Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzym das schnitt DNA-Moleküle. Jedes Enzym erkennt einzigartige Sequenzen von Nukleotiden in einem DNA-Strang - normalerweise etwa vier bis sechs Basenpaare lang. Die Sequenzen sind insofern palindrom, als der komplementäre DNA-Strang in umgekehrter Richtung dieselbe Sequenz aufweist. Mit anderen Worten, beide DNA-Stränge werden an derselben Stelle geschnitten.
Wo diese Enzyme gefunden werden
Restriktionsenzyme kommen in vielen verschiedenen Bakterienstämmen vor, deren biologische Rolle darin besteht, an der Zellabwehr teilzunehmen. Diese Enzyme beschränken fremde (virale) DNA, die in die Zellen gelangt, indem sie diese zerstören. Die Wirtszellen haben ein Restriktionsmodifikationssystem, das ihre eigene DNA an Stellen methyliert, die für ihre jeweiligen Restriktionsenzyme spezifisch sind, wodurch sie vor Spaltung geschützt werden. Mehr als 800 bekannte Enzyme wurden entdeckt, die mehr als 100 verschiedene Nukleotidsequenzen erkennen.
Arten von Restriktionsenzymen
Es gibt fünf verschiedene Arten von Restriktionsenzymen. Typ I schneidet DNA an zufälligen Stellen bis zu 1.000 oder mehr Basenpaaren von der Erkennungsstelle entfernt. Typ III schneidet an ungefähr 25 Basenpaaren von der Stelle. Beide Typen erfordern ATP und können große Enzyme mit mehreren Untereinheiten sein. Typ-II-Enzyme, die überwiegend in der Biotechnologie verwendet werden, schneiden DNA innerhalb der erkannten Sequenz ohne ATP und sind kleiner und einfacher.
Restriktionsenzyme vom Typ II werden nach der Bakterienart benannt, aus der sie isoliert werden. Beispielsweise wurde das Enzym EcoRI aus E. isoliert. coli. Der Großteil der Öffentlichkeit ist mit E. vertraut. Coli-Ausbrüche in Lebensmitteln.
Restriktionsenzyme vom Typ II können zwei verschiedene Arten von Schnitten erzeugen, je nachdem, ob sie beide schneiden Stränge in der Mitte der Erkennungssequenz oder jeder Strang näher an einem Ende der Erkennung Reihenfolge.
Der erstere Schnitt erzeugt "stumpfe Enden" ohne Nukleotidüberhänge. Letzteres erzeugt "klebrige" oder "kohäsive" Enden, da jedes resultierende DNA-Fragment einen Überhang aufweist, der die anderen Fragmente ergänzt. Beide sind in der Molekulargenetik nützlich für die Herstellung rekombinante DNA und Proteine. Diese Form der DNA zeichnet sich dadurch aus, dass sie durch Ligation (Bindung) von zwei oder mehr verschiedenen Strängen entsteht, die ursprünglich nicht miteinander verbunden waren.
Typ IV-Enzyme erkennen methylierte DNA, und Typ V-Enzyme verwenden RNAs, um Sequenzen auf eindringenden Organismen zu schneiden, die nicht palindrom sind.
Verwendung in der Biotechnologie
Restriktionsenzyme werden in der Biotechnologie verwendet, um DNA in kleinere Stränge zu schneiden, um Fragmentlängenunterschiede zwischen Individuen zu untersuchen. Dies wird als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) bezeichnet. Sie werden auch zum Klonen von Genen verwendet.
RFLP-Techniken wurden verwendet, um zu bestimmen, dass Individuen oder Gruppen von Individuen in bestimmten Bereichen des Genoms deutliche Unterschiede in Gensequenzen und Restriktionsspaltungsmustern aufweisen. Die Kenntnis dieser einzigartigen Bereiche ist die Grundlage für DNA-Fingerabdruck-Methode. Jede dieser Methoden hängt von der Verwendung von ab Agarose-Gelelektrophorese zur Trennung der DNA-Fragmente. TBE-Puffer, der aus Tris-Base, Borsäure und EDTA besteht, wird üblicherweise für Agarosegel verwendet Elektrophorese DNA-Produkte zu untersuchen.
Verwendung beim Klonen
Das Klonieren erfordert oft die Insertion eines Gens in ein Plasmid, das eine Art DNA-Stück ist. Restriktionsenzyme können den Prozess aufgrund der einzelsträngigen Überhänge unterstützen, die sie beim Schneiden hinterlassen. DNA-Ligase, ein separates Enzym, kann zwei DNA-Moleküle mit passenden Enden miteinander verbinden.
Durch die Verwendung von Restriktionsenzymen mit DNA-Ligaseenzymen können DNA-Stücke aus verschiedenen Quellen verwendet werden, um ein einzelnes DNA-Molekül zu erzeugen.