Wie schneiden Restriktionsenzyme DNA-Sequenzen?

In der Natur, Organismen müssen sich ständig vor fremden Eindringlingen schützen, auch auf mikroskopischer Ebene. In Bakterien gibt es eine Gruppe von bakteriellen Enzymen, die durch den Abbau von Fremdstoffen wirken DNA. Dieser Demontageprozess wird Restriktion genannt, und die Enzyme, die diesen Prozess ausführen, werden Restriktionsenzyme genannt.

Restriktionsenzyme sind in sehr wichtig rekombinante DNA-Technologie. Restriktionsenzyme wurden verwendet, um Impfstoffe, pharmazeutische Produkte, insektenresistente Pflanzen und eine Vielzahl anderer Produkte herzustellen.

Die zentralen Thesen

Restriktionsenzyme sind eine Klasse von Enzymen, die DNA basierend auf der Erkennung einer bestimmten Sequenz von Nukleotiden in Fragmente schneiden. Restriktionsenzyme sind auch als Restriktionsendonukleasen bekannt.

Obwohl es Hunderte verschiedener Restriktionsenzyme gibt, arbeiten sie alle im Wesentlichen auf die gleiche Weise. Jeder Enzym hat eine sogenannte Erkennungssequenz oder -stelle. Eine Erkennungssequenz ist typischerweise eine bestimmte, kurze Nukleotid Sequenz in DNA. Die Enzyme schneiden an bestimmten Stellen innerhalb der erkannten Sequenz. Beispielsweise kann ein Restriktionsenzym eine spezifische Sequenz von Guanin, Adenin, Adenin, Thymin, Thymin, Cytosin erkennen. Wenn diese Sequenz vorhanden ist, kann das Enzym gestaffelte Schnitte im Zucker-Phosphat-Rückgrat in der Sequenz vornehmen.

Aber wenn Restriktionsenzyme basierend auf einer bestimmten Sequenz schneiden, wie schützen Zellen wie Bakterien ihre eigene DNA davor, von Restriktionsenzymen zerschnitten zu werden? In einer typischen Zelle Methylgruppen (CH₃) werden zu den Basen in der Sequenz hinzugefügt, um die Erkennung durch die Restriktionsenzyme zu verhindern. Dieser Prozess wird von komplementären Enzymen durchgeführt, die dieselbe Sequenz von Nukleotidbasen wie Restriktionsenzyme erkennen. Die Methylierung von DNA ist als Modifikation bekannt. Mit den Modifikations- und Restriktionsprozessen können Zellen sowohl Fremd-DNA zerschneiden, die eine Gefahr für die Zelle darstellt, während die wichtige DNA der Zelle erhalten bleibt.

Basierend auf der doppelsträngigen Konfiguration der DNA sind die Erkennungssequenzen auf den verschiedenen Beständen symmetrisch, verlaufen jedoch in entgegengesetzte Richtungen. Denken Sie daran, dass die DNA eine "Richtung" hat, die durch die Art des Kohlenstoffs am Ende des Strangs angezeigt wird. Am 5'-Ende ist eine Phosphatgruppe gebunden, während am anderen 3'-Ende eine Hydroxylgruppe gebunden ist. Zum Beispiel:

5 'Ende -... Guanin, Adenin, Adenin, Thymin, Thymin, Cytosin... - 3 'Ende

3 'Ende -... Cytosin, Thymin, Thymin, Adenin, Adenin, Guanin... - 5 'Ende

Wenn zum Beispiel das Restriktionsenzym innerhalb der Sequenz zwischen Guanin und Adenin schneidet, wird es würde dies mit beiden Sequenzen aber an entgegengesetzten Enden tun (da die zweite Sequenz im Gegenteil abläuft Richtung). Da die DNA an beiden Strängen geschnitten wird, gibt es komplementäre Enden, die Wasserstoffbrücken miteinander verbinden können. Diese Enden werden oft als "klebrige Enden" bezeichnet.

Die klebrigen Enden der Fragmente, die durch Restriktionsenzyme erzeugt werden, sind in einer Laborumgebung nützlich. Sie können verwendet werden, um DNA-Fragmente aus verschiedenen Quellen und verschiedenen Organismen zu verbinden. Die Fragmente werden von zusammengehalten Wasserstoffbrücken. Aus chemischer Sicht sind Wasserstoffbrücken schwache Anziehungskräfte und nicht dauerhaft. Unter Verwendung eines anderen Enzymtyps können die Bindungen jedoch dauerhaft gemacht werden.

DNA-Ligase ist ein sehr wichtiges Enzym, das sowohl in der Reproduzieren und Reparatur der DNA einer Zelle. Es hilft dabei, DNA-Stränge miteinander zu verbinden. Es katalysiert eine Phosphodiesterbindung. Diese Bindung ist a kovalente Bindung, viel stärker als die oben erwähnte Wasserstoffbrücke und in der Lage, die verschiedenen Fragmente zusammenzuhalten. Wenn verschiedene Quellen verwendet werden, weist die resultierende rekombinante DNA, die produziert wird, eine neue Kombination von Genen auf.

Es gibt vier große Kategorien von Restriktionsenzymen: Typ I-Enzyme, Typ II-Enzyme, Typ III-Enzyme und Typ IV-Enzyme. Alle haben die gleiche Grundfunktion, aber die verschiedenen Typen werden anhand ihrer Erkennung klassifiziert Reihenfolge, wie sie spalten, ihre Zusammensetzung und ihre Substanzanforderungen (Notwendigkeit und Art von Cofaktoren). Im Allgemeinen schneiden Typ I-Enzyme DNA an Stellen, die von der Erkennungssequenz entfernt sind; Typ II schnitt DNA innerhalb oder nahe der Erkennungssequenz; Typ III schnitt DNA in der Nähe von Erkennungssequenzen; und Typ IV spalten methylierte DNA.

• Biolabs, New England. "Arten von Restriktionsendonukleasen." New England Biolabs: Reagenzien für die Life Sciences-Industrie, www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases/types-of-restriction-endonucleases.
• Reece, Jane B. und Neil A. Campbell. Campbell Biology. Benjamin Cummings, 2011.