Gram-Stain-Verfahren in der Mikrobiologie

Die Gram-Färbung ist eine differenzielle Färbemethode, die zur Zuordnung verwendet wird Bakterien zu einer von zwei Gruppen (grampositiv und gramnegativ) basierend auf den Eigenschaften von ihre Zellwände. Es ist auch als Gram-Färbung oder Gram-Methode bekannt. Das Verfahren ist nach der Person benannt, die die Technik entwickelt hat, dem dänischen Bakteriologen Hans Christian Gram.

Das Verfahren basiert auf der Reaktion zwischen Peptidoglycan in den Zellwänden einiger Bakterien. Bei der Gram-Färbung werden Bakterien angefärbt, die Farbe mit einem Beizmittel fixiert, die Zellen entfärbt und eine Gegenfärbung aufgetragen.

1. Der primäre Fleck (Kristallviolett) bindet an Peptidoglycan und färbt die Zellen lila. Sowohl grampositive als auch gramnegative Zellen haben Peptidoglycan in ihren Zellwänden, so dass anfänglich alle Bakterien violett färben.
2. Grams Jod (Jod und Kaliumiodid) wird als Beizmittel oder Fixiermittel angewendet. Grampositive Zellen bilden einen Kristallviolett-Jod-Komplex.
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3. Alkohol oder Aceton wird verwendet, um die Zellen zu entfärben. Gramnegative Bakterien haben viel weniger Peptidoglycan in ihren Zellwänden, so dass dieser Schritt sie im Wesentlichen farblos macht. während nur ein Teil der Farbe von grampositiven Zellen entfernt wird, die mehr Peptidoglycan (60-90% der Zellwand) aufweisen. Die dicke Zellwand von grampositiven Zellen wird durch den Entfärbungsschritt dehydriert, wodurch sie schrumpfen und den Färbe-Jod-Komplex im Inneren einfangen.
4. Nach dem Entfärbungsschritt wird eine Gegenfärbung (normalerweise Safranin, manchmal aber auch Fuchsin) aufgetragen, um die Bakterien rosa zu färben. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien nehmen den rosa Fleck auf, sind jedoch über dem dunkleren Purpur der grampositiven Bakterien nicht sichtbar. Wenn das Färbeverfahren korrekt durchgeführt wird, sind grampositive Bakterien lila, während gramnegative Bakterien rosa sind.

Die Ergebnisse der Gram-Färbung werden angezeigt unter Verwendung von Lichtmikroskopie. Da die Bakterien gefärbt sind, wird nicht nur ihre Gram-Färbungsgruppe identifiziert, sondern auch ihre Form, Größe und Verklumpungsmuster können beobachtet werden. Dies macht die Gram-Färbung zu einem wertvollen Diagnosewerkzeug für eine medizinische Klinik oder ein Labor. Während der Fleck Bakterien möglicherweise nicht eindeutig identifiziert, reicht es oft aus, zu wissen, ob sie grampositiv oder gramnegativ sind, um ein wirksames Antibiotikum zu verschreiben.

Einige Bakterien können gramvariabel oder gramunbestimmt sein. Selbst diese Informationen können jedoch nützlich sein, um die bakterielle Identität einzugrenzen. Die Technik ist am zuverlässigsten, wenn Kulturen weniger als 24 Stunden alt sind. Während es für Bouillonkulturen verwendet werden kann, ist es am besten, sie zuerst zu zentrifugieren. Die Hauptbeschränkung der Technik besteht darin, dass sie fehlerhafte Ergebnisse liefert, wenn Fehler in der Technik gemacht werden. Übung und Geschick sind erforderlich, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen. Ein infektiöser Erreger kann auch nicht bakteriell sein. Eukaryontische Krankheitserreger färben sich gramnegativ. Die meisten jedoch eukaryotische Zellen mit Ausnahme von Pilzen (einschließlich Hefe), die während des Vorgangs nicht am Objektträger haften bleiben.

• Kristallviolett (Primärfärbung)
• Grams Jod (Beizmittel, um Kristallviolett in der Zellwand zu fixieren)
• Ethanol oder Aceton (Entfärber)
• Safranin (Sekundärfärbung oder Gegenfärbung)
• Wasser in einer Spritzflasche oder Tropfflasche
• Mikroskopische Objektträger
• Verbundmikroskop

1. Geben Sie einen kleinen Tropfen Bakterienprobe auf einen Objektträger. Hitze fixieren Sie die Bakterien auf dem Objektträger, indem Sie sie dreimal durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen. Wenn Sie zu viel oder zu lange Wärme anwenden, können die Zellwände der Bakterien schmelzen, ihre Form verzerren und zu einem ungenauen Ergebnis führen. Wenn zu wenig Wärme angewendet wird, waschen die Bakterien den Objektträger während der Färbung ab.
2. Verwenden Sie eine Pipette, um den Primärfleck (Kristallviolett) auf den Objektträger aufzutragen, und lassen Sie ihn 1 Minute lang ruhen. Spülen Sie den Objektträger vorsichtig nicht länger als 5 Sekunden mit Wasser, um überschüssige Flecken zu entfernen. Ein zu langes Spülen kann zu viel Farbe entfernen, während ein zu langes Spülen dazu führen kann, dass zu viel Fleck auf gramnegativen Zellen verbleibt.
3. Verwenden Sie eine Pipette, um Grams Jod auf den Objektträger aufzutragen und das Kristallviolett an der Zellwand zu befestigen. 1 Minute ruhen lassen.
4. Spülen Sie den Objektträger ca. 3 Sekunden lang mit Alkohol oder Aceton und spülen Sie ihn anschließend vorsichtig mit Wasser ab. Die gramnegativen Zellen verlieren Farbe, während die grampositiven Zellen violett oder blau bleiben. Wenn der Entfärber jedoch zu lange eingeschaltet bleibt, verlieren alle Zellen Farbe!
5. Tragen Sie den Sekundärfleck Safranin auf und lassen Sie ihn 1 Minute einwirken. Vorsichtig nicht länger als 5 Sekunden mit Wasser abspülen. Die gramnegativen Zellen sollten rot oder rosa gefärbt sein, während die grampositiven Zellen immer noch lila oder blau erscheinen.
6. Betrachten Sie den Objektträger mit einem Verbundmikroskop. Eine Vergrößerung von 500x bis 1000x kann erforderlich sein, um die Form und Anordnung der Zellen zu unterscheiden.

Nicht alle durch die Gram-Färbung identifizierten Bakterien sind mit Krankheiten assoziiert, aber einige wichtige Beispiele sind:

• Grampositive Kokken (rund):Staphylococcus aureus
• Gramnegative Kokken:Meningokokken
• Grampositive Bazillen (Stäbchen): Bacillus anthracis
• Gramnegative Bazillen:Escherichia coli