Wie Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation von Genen funktioniert

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine molekulargenetische Technik zur Herstellung mehrerer Kopien eines Gens und ist auch Teil des Gensequenzierungsprozesses.

Genkopien werden mit einer DNA-Probe erstellt, und die Technologie ist gut genug, um mehrere Kopien von einer einzigen Kopie des in der Probe gefundenen Gens zu erstellen. Die PCR-Amplifikation eines Gens, um Millionen von Kopien herzustellen, ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung von Gensequenzen unter Verwendung visueller Techniken basierend auf Größe und Ladung (+ oder -) des DNA-Stücks.

Unter kontrollierten Bedingungen werden kleine DNA-Segmente durch Enzyme, die als DNA-Polymerasen bekannt sind, erzeugt, die komplementäre Desoxynukleotide hinzufügen (dNTPs) zu einem DNA-Stück, das als "Template" bekannt ist. Auch kleinere DNA-Stücke, sogenannte "Primer", dienen als Ausgangspunkt für die Polymerase.

Primer sind kleine, künstlich hergestellte DNA-Stücke (Oligomere), die normalerweise zwischen 15 und 30 Nukleotiden lang sind. Sie werden hergestellt, indem man kurze DNA-Sequenzen an den äußersten Enden des zu amplifizierenden Gens kennt oder errät. Während der PCR wird die zu sequenzierende DNA erhitzt und die Doppelstränge werden getrennt. Beim Abkühlen binden die Primer an die Matrize (Annealing genannt) und schaffen einen Platz für den Beginn der Polymerase.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde durch die Entdeckung thermophiler und thermophiler Polymerase-Enzyme (Enzyme, die die strukturelle Integrität und Funktionalität nach dem Erhitzen bei hoher aufrechterhalten) Temperaturen). Die Schritte der PCR-Technik sind wie folgt:

• Es wird eine Mischung mit optimierten Konzentrationen des DNA-Templates, des Polymerase-Enzyms, der Primer und der dNTPs erstellt. Die Fähigkeit, die Mischung ohne Denaturierung des Enzyms ermöglicht die Denaturierung der Doppelhelix der DNA-Probe bei Temperaturen im Bereich von 94 Grad Celsius.
• Nach der Denaturierung wird die Probe auf einen gemäßigteren Bereich, etwa 54 Grad, abgekühlt, was das Annealing (Bindung) der Primer an die einzelsträngigen DNA-Matrizen erleichtert.
• Im dritten Schritt des Zyklus wird die Probe zur Elongation wieder auf 72 Grad erhitzt, die ideale Temperatur für die Taq DNA Polymerase. Während der Elongation verwendet die DNA-Polymerase den ursprünglichen DNA-Einzelstrang als Matrize, um komplementäre dNTPs. hinzuzufügen an die 3'-Enden jedes Primers und erzeugen Sie einen Abschnitt doppelsträngiger DNA in der Region des interessierenden Gens.
• Primer, die an DNA-Sequenzen angelagert sind, die nicht exakt übereinstimmen, bleiben bei 72 Grad nicht angelagert, wodurch die Elongation auf das interessierende Gen beschränkt wird.

Dieser Vorgang des Denaturierens, Anlagerns und Elongierens wird mehrfach (30-40) Mal wiederholt, wodurch die Anzahl der Kopien des gewünschten Gens in der Mischung exponentiell erhöht wird. Obwohl dieser Vorgang bei manueller Durchführung recht mühsam wäre, können Proben in einem programmierbarer Thermocycler, mittlerweile in den meisten Molekularlaboren üblich, und eine komplette PCR-Reaktion kann in 3-4 Stunden.

Jeder Denaturierungsschritt stoppt den Elongationsprozess des vorherigen Zyklus, wodurch der neue DNA-Strang abgeschnitten und ungefähr auf die Größe des gewünschten Gens gehalten wird. Die Dauer des Elongationszyklus kann je nach Größe des interessierenden Gens verlängert oder verkürzt werden, aber schließlich durch wiederholte Zyklen von PCR wird die Mehrheit der Templates allein auf die Größe des interessierenden Gens beschränkt sein, da sie aus Produkten beider Grundierungen.

Es gibt mehrere verschiedene Faktoren für eine erfolgreiche PCR die manipuliert werden können, um die Ergebnisse zu verbessern. Die am häufigsten verwendete Methode zum Testen auf das Vorhandensein von PCR-Produkten ist Agarose-Gelelektrophorese. Dies wird verwendet, um DNA-Fragmente basierend auf Größe und Ladung zu trennen. Die Fragmente werden dann mit Farbstoffen oder Radioisotopen sichtbar gemacht.

Seit der Entdeckung der PCR wurden andere DNA-Polymerasen als das ursprüngliche Taq entdeckt. Einige von ihnen haben eine bessere „Korrektur“-Fähigkeit oder sind bei höheren Temperaturen stabiler, wodurch die Spezifität der PCR verbessert und Fehler durch das Einfügen des falschen dNTP reduziert werden.

Einige Varianten der PCR wurden für spezifische Anwendungen entwickelt und werden heute regelmäßig in molekulargenetischen Labors eingesetzt. Einige davon sind Real-Time-PCR und Reverse-Transcriptase-PCR. Die Entdeckung der PCR hat auch zur Entwicklung der DNA-Sequenzierung geführt, DNA-Fingerabdruck-Methode und andere molekulare Techniken.