Methoden zur Proteinreinigung in der Biotechnologie

Ein wichtiger Bestandteil der biotechnologischen Forschung ist der Einsatz von Protein-Engineering-Techniken zum Design oder zur Modifizierung von Proteinen. Diese Proteinreinigungstechniken optimieren die Proteineigenschaften für bestimmte industrielle Anwendungen.

Diese Techniken erfordern, dass Wissenschaftler interessierende Proteine ​​isolieren und reinigen, damit ihre Konformationen und Substratspezifitäten untersucht werden können. Ebenfalls untersucht werden müssen die Reaktionen mit anderen Liganden (ein Protein, das an ein Rezeptorprotein bindet) und spezifische Enzymaktivitäten.

Der erforderliche Grad an Proteinreinheit hängt von der beabsichtigten Endverwendung des Proteins ab. Für einige Anwendungen ist ein Rohextrakt ausreichend. Bei anderen Anwendungen, beispielsweise in Lebensmitteln und Pharmazeutika, ist ein hohes Maß an Reinheit erforderlich. Mehrere Techniken für Proteinreinigung werden verwendet, um einen erforderlichen Reinheitsgrad zu erreichen.

Jeder Proteinreinigungsschritt führt normalerweise zu einem gewissen Grad an Produktverlust. Daher ist eine ideale Proteinreinigungsstrategie eine, bei der der höchste Reinigungsgrad in den wenigsten Schritten erreicht wird.

Die Auswahl der zu verwendenden Schritte hängt von der Größe, Ladung, Löslichkeit und anderen Eigenschaften des Zielproteins ab. Die folgenden Techniken eignen sich am besten zur Reinigung eines einzelnen cytosolischen Proteins.

Die Reinigung von cytosolischen Proteinkomplexen ist komplizierter und erfordert normalerweise die Anwendung verschiedener Methoden.

Der erste Schritt bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ​​(innerhalb der Zelle) ist die Herstellung eines Rohextrakts. Der Extrakt enthält eine komplexe Mischung aller Proteine ​​aus dem Zellzytoplasma sowie einige zusätzliche Makromoleküle, Cofaktoren und Nährstoffe.

Dieser Rohextrakt kann für einige Anwendungen in der Biotechnologie verwendet werden. Wenn jedoch die Reinheit ein Problem darstellt, müssen nachfolgende Reinigungsschritte befolgt werden. Rohe Proteinextrakte werden durch Entfernen von Zelltrümmern hergestellt, die durch Zelllyse erzeugt werden, was unter Verwendung von Chemikalien erreicht wird. Enzyme, Beschallung oder eine französische Presse.

Die Rückstände werden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand (die Flüssigkeit über einem festen Rückstand) wird gewonnen. Rohe Präparationen von extrazellulären (außerhalb der Zelle) Proteinen können durch einfaches Entfernen der Zellen durch Zentrifugation erhalten werden.

Ganz bestimmt Biotechnologie Anwendungen besteht ein Bedarf an thermostabilen Enzymen - Enzymen, die hohe Temperaturen ohne Denaturierung vertragen und gleichzeitig eine hohe spezifische Aktivität aufrechterhalten können.

Organismen, die hitzebeständige Proteine ​​produzieren, werden manchmal als Extremophile bezeichnet. Ein einfacher Ansatz zur Reinigung eines hitzebeständigen Proteins besteht darin, die anderen Proteine ​​in der Mischung durch zu denaturieren Erhitzen, dann Abkühlen der Lösung (wodurch sich das thermostabile Enzym reformieren oder wieder auflösen kann, wenn notwendig). Die denaturierten Proteine ​​können dann durch Zentrifugation entfernt werden.

Modern Biotech Protokolle nutzen häufig die vielen im Handel erhältlichen Kits oder Methoden, die vorgefertigte Lösungen für Standardverfahren bieten. Die Proteinreinigung wird häufig unter Verwendung von Filtern und vorbereiteten Gelfiltrationssäulen durchgeführt.

Befolgen Sie die Anweisungen des Dialysekits, geben Sie das richtige Volumen der richtigen Lösung hinzu und warten Sie auf die festgelegte Zeitdauer beim Sammeln des Elutionsmittels (des durch die Säule geleiteten Lösungsmittels) in einem frischen Test Tube.

Chromatographische Methoden können unter Verwendung von Tischsäulen oder automatisierten HPLC-Geräten angewendet werden. Die Trennung durch HPLC kann durch Umkehrphasen-, Ionenaustausch- oder Größenausschlussverfahren und durch Diodenarray- oder Lasertechnologie detektierte Proben erfolgen.

In der Vergangenheit war ein üblicher zweiter Schritt zur Reinigung eines Proteins aus einem Rohextrakt die Ausfällung in einer Lösung mit hoher osmotischer Stärke (d. H. Salzlösungen). Die Proteinfällung erfolgt üblicherweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat als Salz. Nukleinsäuren im Rohextrakt können durch Ausfällen von mit Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat gebildeten Aggregaten entfernt werden.

Salzfällung führt normalerweise nicht zu einem hochgereinigten Protein, kann jedoch dazu beitragen, einige unerwünschte Proteine ​​in einer Mischung zu entfernen und die Probe zu konzentrieren. Die Salze in der Lösung werden dann durch Dialyse durch poröse Celluloseschläuche, Filtration oder Gelausschlusschromatographie entfernt.

Verschiedene Proteine ​​fallen in unterschiedlichen Konzentrationen von Ammoniumsulfat aus. Im Allgemeinen fallen Proteine ​​mit höherem Molekulargewicht in niedrigeren Konzentrationen von Ammoniumsulfat aus.

Die Umkehrphasenchromatographie (RPC) trennt Proteine ​​anhand ihrer relativen Hydrophobie (Ausschluss unpolarer Moleküle aus Wasser). Diese Technik ist hochselektiv, erfordert jedoch die Verwendung organischer Lösungsmittel.

Einige Proteine ​​werden durch Lösungsmittel permanent denaturiert und verlieren während der RPC ihre Funktionalität. Daher wird diese Methode nicht für alle Anwendungen empfohlen, insbesondere wenn das Zielprotein seine Aktivität beibehalten muss.

Ionenaustauschchromatographie bezieht sich auf die Trennung von Proteinen basierend auf Ladung. Säulen können entweder für den Anionenaustausch oder den Kationenaustausch vorbereitet werden. Anionenaustauschsäulen enthalten eine stationäre Phase mit einer positiven Ladung, die negativ geladene Proteine ​​anzieht.

Kationenaustauschsäulen sind die umgekehrten, negativ geladenen Perlen, die positiv geladene Proteine ​​anziehen. Die Elution (Extrahieren eines Materials aus einem anderen) des Zielproteins (der Zielproteine) erfolgt durch Ändern des pH-Werts in die Säule, die zu einer Änderung oder Neutralisation der geladenen funktionellen Gruppen von jeder führt Protein.

Die Größenausschlusschromatographie (auch als Gelfiltration bekannt) trennt größere Proteine ​​von kleineren solche, da sich die größeren Moleküle in der Chromatographie schneller durch das vernetzte Polymer bewegen Säule. Die großen Proteine ​​passen nicht in die Poren des Polymers, während kleinere Proteine ​​auf einem weniger direkten Weg länger durch die Chromatographiesäule wandern.

Eluat (das Ergebnis der Elution) wird in einer Reihe von Röhrchen gesammelt, die Proteine ​​basierend auf der Elutionszeit trennen. Die Gelfiltration ist ein nützliches Werkzeug zum Konzentrieren einer Proteinprobe, da das Zielprotein in einem kleineren Elutionsvolumen gesammelt wird, als ursprünglich der Säule zugesetzt wurde. Ähnliche Filtrationstechniken könnten aufgrund ihrer Kosteneffizienz während der Proteinproduktion in großem Maßstab verwendet werden.

Die Affinitätschromatographie ist eine sehr nützliche Technik zum "Polieren" oder zum Abschließen des Proteinreinigungsprozesses. Perlen in der Chromatographiesäule sind mit Liganden vernetzt, die spezifisch an das Zielprotein binden.

Das Protein wird dann durch Spülen mit einer Lösung, die freie Liganden enthält, von der Säule entfernt. Diese Methode liefert im Vergleich zu anderen Techniken die reinsten Ergebnisse und die höchste spezifische Aktivität.

SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat, das bei der Polyacrylamidgelelektrophorese verwendet wird) bindet an Proteine ​​und gibt ihnen eine große negative Nettoladung. Da die Ladungen aller Proteine ​​ziemlich gleich sind, werden sie bei dieser Methode fast vollständig nach Größe getrennt.

SDS-PAGE wird häufig verwendet, um die Reinheit des Proteins nach jedem Schritt in einer Reihe zu testen. Wenn unerwünschte Proteine ​​allmählich aus der Mischung entfernt werden, wird die Anzahl der auf dem SDS-PAGE-Gel sichtbaren Banden verringert, bis nur noch eine Bande das gewünschte Protein darstellt.

Immunoblot ist eine Proteinvisualisierungstechnik, die in Kombination mit Affinitätschromatographie angewendet wird. Antikörper für ein bestimmtes Protein werden als Liganden auf einer Affinitätschromatographiesäule verwendet.

Das Zielprotein wird auf der Säule zurückgehalten und dann durch Spülen der Säule mit einer Salzlösung oder anderen Mitteln entfernt. Mit radioaktiven Markierungen oder Farbstoffmarkierungen verknüpfte Antikörper unterstützen den Nachweis des Zielproteins, sobald es vom Rest der Mischung getrennt ist.