Anleitung zur Herstellung eines einfachen Phosphatpuffers

In der Chemie a PufferLösung dient zur Aufrechterhaltung eines stabilen pH-Werts, wenn eine kleine Menge Säure oder Base in eine Lösung eingeführt wird. Eine Phosphatpufferlösung ist besonders nützlich für biologische Anwendungen, die besonders empfindlich gegenüber pH-Änderungen sind, da es möglich ist, eine Lösung in der Nähe eines von drei pH-Niveaus herzustellen.

Die drei pKa-Werte für Phosphorsäure (aus dem CRC Handbuch für Chemie und Physik) sind 2,16, 7,21 und 12,32. Mononatriumphosphat und seine konjugierte Base, Dinatriumphosphat, werden üblicherweise verwendet, um Puffer mit pH-Werten um 7 für biologische Anwendungen zu erzeugen, wie hier gezeigt.

• Hinweis: Denken Sie daran, dass pKa nicht einfach auf einen genauen Wert gemessen werden kann. In der Literatur sind möglicherweise leicht unterschiedliche Werte aus verschiedenen Quellen verfügbar.

Das Erstellen dieses Puffers ist etwas komplizierter als das Erstellen von TAE- und TBE-Puffern, aber der Vorgang ist nicht schwierig und sollte nur etwa 10 Minuten dauern.

Für die Herstellung Ihres Phosphatpuffers benötigen Sie folgende Materialien:

• Mononatriumphosphat
• Dinatriumphosphat.
• Phosphorsäure oder Natriumhydroxid (NaOH)
• pH-Meter und Sonde
• Messkolben
• Messzylinder
• Becher
• Riegel umrühren
• Kochplatte umrühren

Bevor Sie einen Puffer herstellen, sollten Sie zunächst wissen, welche Molarität Sie haben möchten, welches Volumen Sie herstellen möchten und welchen pH-Wert Sie wünschen. Die meisten Puffer funktionieren am besten bei Konzentrationen zwischen 0,1 M und 10 M. Der pH-Wert sollte innerhalb von 1 pH-Einheit der Säure / Konjugat-Base pKa liegen. Der Einfachheit halber erzeugt diese Beispielberechnung 1 Liter Puffer.

Verwenden Sie die Henderson-Hasselbalch (HH) -Gleichung (unten), um zu bestimmen, welches Verhältnis von Säure zu Base erforderlich ist, um einen Puffer mit dem gewünschten pH-Wert herzustellen. Verwenden Sie den pKa-Wert, der Ihrem gewünschten pH-Wert am nächsten liegt. Das Verhältnis bezieht sich auf das Säure-Base-Konjugatpaar, das diesem pKa entspricht.

HH-Gleichung: pH = pKa + log ([Base] / [Säure])

Für einen Puffer mit einem pH-Wert von 6,9 ist [Base] / [Säure] = 0,4898

Ersetzen Sie [Säure] und lösen Sie [Base]

Die gewünschte Molarität des Puffers ist die Summe von [Säure] + [Base].

Für einen 1 M Puffer ist [Base] + [Acid] = 1 und [Base] = 1 - [Säure]

Wenn Sie dies ab Schritt 2 in die Verhältnisgleichung einsetzen, erhalten Sie:

[Säure] = 0,6712 Mol / l

Löse nach [Säure]

Mit der Gleichung: [Base] = 1 - [Acid] können Sie Folgendes berechnen:

[Base] = 0,3288 Mol / l

Nachdem Sie die verwendet haben Henderson-Hasselbalch Um das für Ihren Puffer erforderliche Verhältnis von Säure zu Base zu berechnen, stellen Sie knapp 1 Liter Lösung mit den richtigen Mengen an Mononatriumphosphat und Dinatriumphosphat her.

Verwenden Sie eine pH-Sonde, um zu bestätigen, dass der richtige pH-Wert für den Puffer erreicht ist. Bei Bedarf mit Phosphorsäure oder Natriumhydroxid (NaOH) leicht einstellen.

Sobald der gewünschte pH-Wert erreicht ist, bringen Sie das Puffervolumen auf 1 Liter. Dann verdünnen Sie den Puffer wie gewünscht. Derselbe Puffer kann verdünnt werden, um Puffer von 0,5 M, 0,1 M, 0,05 M oder irgendetwas dazwischen zu erzeugen.

Hier sind zwei Beispiele, wie ein Phosphatpuffer berechnet werden kann, wie von Clive Dennison, Abteilung für Biochemie an der Universität von Natal, Südafrika, beschrieben.

Voraussetzung ist ein 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,6.

In der Henderson-Hasselbalch-Gleichung, pH = pKa + log ([Salz] / [Säure]), ist das Salz Na2HPO4 und die Säure ist NaHzPO4. Ein Puffer ist am effektivsten bei seinem pKa, dem Punkt, an dem [Salz] = [Säure] ist. Aus der Gleichung geht hervor, dass der pH-Wert größer als pKa ist, wenn [Salz]> [Säure], und wenn [Salz]

NaH 2 PO 4 + NaOH - + Na 2 HPO 4 + H 20.

Sobald die Lösung auf den richtigen pH-Wert titriert wurde, kann sie verdünnt werden (zumindest über einen kleinen Wert) Bereich, so dass die Abweichung vom idealen Verhalten gering ist) zu dem Volumen, das das gewünschte ergibt Molarität. Die HH-Gleichung besagt, dass das Verhältnis von Salz zu Säure anstelle ihrer absoluten Konzentrationen den pH-Wert bestimmt. Beachten Sie, dass:

• Bei dieser Reaktion ist das einzige Nebenprodukt Wasser.
• Die Molarität des Puffers wird durch die Masse der abgewogenen Säure NaH 2 PO 4 und das Endvolumen, aus dem die Lösung besteht, bestimmt. (Für dieses Beispiel wären 15,60 g Dihydrat pro Liter Endlösung erforderlich.)
• Die Konzentration des NaOH spielt keine Rolle, so dass jede beliebige Konzentration verwendet werden kann. Es sollte natürlich ausreichend konzentriert sein, um die erforderliche pH-Änderung des verfügbaren Volumens zu bewirken.
• Die Reaktion impliziert, dass nur eine einfache Berechnung der Molarität und ein einziges Wiegen erforderlich sind: nur eines Die Lösung muss hergestellt werden, und das gesamte abgewogene Material wird im Puffer verwendet - das heißt, es gibt keine Abfall.

Beachten Sie, dass es nicht korrekt ist, das "Salz" (Na2HPO4) zunächst abzuwiegen, da dies ein unerwünschtes Nebenprodukt ergibt. Wenn eine Lösung des Salzes hergestellt wird, liegt sein pH-Wert über dem pKa und es muss mit einer Säure titriert werden, um den pH-Wert zu senken. Wenn HCl verwendet wird, ist die Reaktion:

Na 2 HPO 4 + HCl - + NaH 2 PO 4 + NaCl,

Man erhält NaCl einer unbestimmten Konzentration, die im Puffer nicht erwünscht ist. Manchmal - zum Beispiel bei einer Ionenaustausch-Ionenstärke-Gradientenelution - ist es erforderlich, dass dem Puffer ein Gradient von beispielsweise [NaCl] überlagert wird. Für die beiden Kammern des Gradientengenerators sind dann zwei Puffer erforderlich: der Startpuffer (dh der Äquilibrierungspuffer ohne Zusatz von NaCl oder mit dem Ausgangskonzentration von NaCl) und dem Endpuffer, der derselbe wie der Startpuffer ist, aber zusätzlich die Endkonzentration von NaCl enthält. Bei der Herstellung des Finishing-Puffers müssen häufige Ioneneffekte (aufgrund des Natriumions) berücksichtigt werden.

Beispiel wie in der Zeitschrift Biochemical Education angegeben16(4), 1988.

Die Anforderung ist ein Ionenstärke-Gradienten-Finishing-Puffer, 0,1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,6, der 1,0 M NaCl enthält.

In diesem Fall wird das NaCl zusammen mit dem NaHEPO4 abgewogen und aufgefüllt; Bei der Titration werden häufige Ioneneffekte berücksichtigt und komplexe Berechnungen vermieden. Für 1 Liter Puffer werden NaH2PO4.2H20 (15,60 g) und NaCl (58,44 g) in etwa 950 ml destilliertem H20 gelöst. mit einer ziemlich konzentrierten NaOH-Lösung (aber von beliebiger Konzentration) auf pH 7,6 titriert und auf 1 aufgefüllt Liter.

Beispiel wie in der Zeitschrift Biochemical Education angegeben16(4), 1988.